De karakters van Eén vloog over het koekoeksnest bestaat uit patiënten in een psychiatrisch ziekenhuis in Oregon, het personeel en een paar andere personages in dezelfde baan.
Een held uit de Koreaanse oorlog, Randle Patrick McMurphy, is de hoofdrolspeler in de roman en hij werd opgenomen in het ziekenhuis om dwangarbeid te voorkomen. Hij kwam uit Pendelton Prison Farm, waar hij op de een of andere manier de diagnose psychotisch kreeg, ondanks het feit dat hij eigenlijk gezond was. Een opstandige, anti-academische handarbeider die zich bezighoudt met gokken, off-kilter seksuele opmerkingen en andere capriolen, hij wordt de feitelijke leider van de patiënten. Hij leert hen de willekeurige en repressieve leerstellingen van Nurse Ratched in vraag te stellen. Hij komt naar het ziekenhuis in de overtuiging dat zijn verblijf op de psychiatrische afdeling comfortabeler zou zijn dan een straf op de Pendleton Work Farm.
Ondanks zijn zelfbeschikking krijgt het ziekenhuis echter controle over hem. Zijn lot wordt voorafgegaan door wat er gebeurt met Maxwell Taber, een voormalige heethoofdige patiënt die werd onderworpen aan een elektroshockbehandeling, waardoor hij niet kon nadenken.
Verpleegster Ratched geeft de dood van een van de gevangenen de schuld van hem, en bijgevolg valt hij haar aan. Dit resulteert in het krijgen van een lobotomie, en uiteindelijk wordt hij in zijn slaap gedood door Chief Bromden. Hij en Bromden hebben tegengestelde verhaalbogen: Bromden begint ingetogen en blijkbaar dom, om vervolgens tot zijn zinnen te komen; McMurphy daarentegen is assertief en slim aan het begin van de roman, maar eindigt gelobotomiseerd en geëuthanaseerd.
Chief Bromden is de verteller van de roman, een man van gemengd Amerikaans en blanke afkomst. Gediagnosticeerd als een paranoïde schizofreen, doet hij alsof hij doof en stom is om de krachten van de 'Combine' te ontwijken, een matrix die achter de muren en de vloeren neuriet die mensen hun vrijheid wil ontnemen. Hij ligt al meer dan 10 jaar in het ziekenhuis, langer dan elke andere patiënt. “Ik was het niet die zich doof begon te gedragen; het waren mensen die zich voor het eerst begonnen te gedragen alsof ik te dom was om helemaal niets te horen, te zien of te zeggen, 'beseft hij uiteindelijk.
McMurphy rehabiliteert hem en uiteindelijk rebelleren beiden actief tegen het repressieve personeel van het ziekenhuis. Nadat verpleegster Ratched McMurphy gelobotomiseerd heeft, doodt Chief hem - eigenlijk, euthaniseert hem - terwijl hij slaapt, en ontsnapt dan uit het ziekenhuis.
Nurse Ratched is de antagonist van de roman. Ze is een voormalige legerverpleegster, ook bekend als 'Big Nurse', en heeft een machine-achtige houding, hoewel haar gevel soms afbrokkelt en ze haar lelijke kant laat zien.
Ze is de de facto heerser van de wijk en handhaaft de orde door absolute autoriteit uit te oefenen over personeel en patiënten. Ze kan zowel als een "engel van genade" als een folteraar optreden, omdat ze alle zwakke plekken van haar patiënten kent, tot het punt dat ze voornamelijk schaamte en schuld gebruikt om haar macht uit te oefenen.
Haar grote borsten worden op de een of andere manier gezien als een ondermijnende kracht in haar streven naar absolute autoriteit en geven haar het uiterlijk van een verwrongen moederfiguur. Gezien het feit dat McMurphy de belichaming is van rauwe mannelijkheid, gedraagt hij zich als een tegenkracht voor Nurse Ratched, die het gevoel heeft dat ze hem moet beheersen. McMurphy vergelijkt de technieken van Nurse Ratched met de hersenkrakende capriolen die de communisten tijdens de Koreaanse oorlog gebruikten.
Een 'acute' patiënt, hij is een universiteitsgeschoolde man die zich vrijwillig aan de afdeling heeft verbonden. Hij is behoorlijk verwijfd en psychologisch gecastreerd, zowel door Nurse Ratched als zijn vrouw.
Billy Bibbit is een 31-jarige man met een dominante moeder, in die mate dat hij, ondanks zijn volwassen leeftijd, nog steeds maagd is. Een vrijwillig toegewijde acute, Bibbit slaagt erin om zijn maagdelijkheid te verliezen aan de prostituee Candy Starr (dankzij de regeling van McMurphy). Eenmaal gevangen genomen door verpleegster Ratched, wordt hij echter door haar beschaamd en terwijl hij in de spreekkamer wacht, sterft hij door zijn keel door te snijden. Hij heeft vlekken op zijn polsen, die eerdere zelfmoordpogingen aangeven.
Cheswick is de eerste patiënt die de rebellerende houding van McMurphy volgt. Zodra McMurphy echter ingetogen raakt, verdrinkt Cheswick zichzelf wanneer hem zijn sigaretten wordt ontzegd.
Een van de verpleegkundigen op de psychiatrische afdeling, is het niet eens met de methoden van Nurse Ratched en is het enige vrouwelijke personage dat noch een "hoer" noch een "ball cutter" is.