De twee centrale karakters in Van muizen en mannen zijn George Milton en Lennie Small, twee migrerende veldwerkers die in de jaren dertig op zoek waren naar landbouwwerk in Zuid-Californië. Wanneer het boek begint, zijn George en Lennie net aangekomen op een nieuwe boerderij; daar ontmoeten George en Lennie - en via hen de lezers - een fascinerende cast van personages.
Lennie Small is een grote, zachtaardige migrerende werknemer met een verstandelijke beperking. Hij vertrouwt op George Milton, zijn levenslange vriend en collega-migrerende werknemer, voor begeleiding en veiligheid. In aanwezigheid van George verdedigt Lennie zijn gezaghebbende vriend, maar wanneer George niet in de buurt is, spreekt Lennie vrijer. Soms laat hij informatie achter die George hem vertelde geheim te houden, zoals hun plan om een stuk grond te kopen.
Lennie houdt ervan om iets zachts aan te raken, van stof tot de vacht van een muis tot het haar van een vrouw. Hij is een klassieke, vriendelijke reus die nooit schade probeert aan te richten, maar zijn fysieke kracht leidt onbedoeld tot vernietiging. We leren van George dat hij en Lennie hun laatste boerderij moesten verlaten omdat Lennie er niet van kon weerhouden de jurk van een vrouw aan te raken en uiteindelijk werd beschuldigd van verkrachting. Wanneer Lennie een puppy ontvangt als geschenk van een van de andere veldwerkers, doodt hij het per ongeluk door het te sterk te aaien. Het onvermogen van Lennie om zijn fysieke kracht in toom te houden, leidt tot problemen voor beide mannen, met name wanneer hij Curley's vrouw per ongeluk vermoordt.
George Milton is zowel een dominante leider als een loyale beschermer van Lennie. De twee mannen groeiden samen op, maar George oefent een groter gezag uit in de vriendschap vanwege de afhankelijkheid van Lennie.
George en Lennie praten vaak over het verkrijgen van een eigen land. Lennie lijkt dit plan zeer serieus te nemen, maar George's betrokkenheid is minder duidelijk. In plaats van bijvoorbeeld geld te sparen om in de toekomst grond te kopen, blaast George zijn spaargeld in één nacht op terwijl hij in een café ronddraait.
George klaagt soms over zijn zorgzame rol, maar hij is duidelijk toegewijd aan het uitkijken naar Lennie. Zijn redenering wordt echter nooit duidelijk uitgelegd. Het kan zijn dat George bij Lennie blijft omdat de relatie hem een gevoel van autoriteit geeft wanneer zijn leven anders zelfbeschikking mist. Hij troost waarschijnlijk ook de bekendheid van Lennie, omdat de twee mannen regelmatig reizen en nooit ergens een claim op het spel zetten.
Nadat Lennie Curley's vrouw per ongeluk heeft vermoord, kiest George ervoor om Lennie te vermoorden. De beslissing is een daad van genade om zijn vriend te redden van het lijden door de andere veldwerkers.
Curley is de agressieve, kort statige zoon van de eigenaar van de ranch. Hij loopt autoritair rond de boerderij en er wordt gezegd dat hij een voormalige bokser van Golden Gloves is. Curley kiest voortdurend gevechten, vooral met Lennie; zo'n gevecht leidt ertoe dat Lennie Curley's hand verplettert.
Curley draagt altijd een handschoen aan een van zijn handen. De andere arbeiders beweren dat de handschoen gevuld is met lotion om zijn hand gevoelig te houden voor zijn vrouw. Curley is in feite erg jaloers en beschermend voor zijn vrouw, en hij vreest vaak dat ze met de andere arbeiders flirt. Nadat Lennie de vrouw van Curley per ongeluk heeft vermoord, leidt Curley de andere arbeiders op een moorddadige jacht op de nieuwkomer.
Candy is een ouder wordende klusjesman die jaren geleden een van zijn handen verloor bij een ongeluk. Vanwege zijn handicap en zijn leeftijd maakt Candy zich zorgen over zijn toekomst op de boerderij. Wanneer Lennie onthult dat hij en George van plan zijn om zelf land te kopen, heeft Candy het gevoel dat hij geluk heeft gehad en hij biedt $ 350 om mee te doen. Candy, net als Lennie, gelooft echt in dit plan, en als gevolg daarvan staat hij sympathiek tegenover George en Lennie gedurende de novelle en gaat zelfs zelfs zo ver dat hij George helpt de jacht op Lennie uit te stellen na de dood van Curley's vrouw.
Crooks, die zijn bijnaam kreeg vanwege zijn misvormde rug, is een stabiele hand en de enige Afro-Amerikaanse werker op de ranch. Vanwege zijn ras is het Crooks niet toegestaan in de schuur met de andere arbeiders te wonen. Crooks is bitter en cynisch, maar kan toch goed opschieten met Lennie, die het racisme van de andere arbeiders niet deelt.
Hoewel George hem tot geheimhouding heeft gezworen, vertelt Lennie aan Crooks dat hij en George van plan zijn land te kopen. Crooks drukt diepe scepsis uit. Hij vertelt Lennie dat hij allerlei mensen heeft horen praten over allerlei plannen, maar dat geen van hen ooit is gebeurd.
Later in dezelfde scène benadert Curley's vrouw de twee mannen, flirterig pratend. Wanneer Crooks haar vraagt om te vertrekken, slingert Curley's vrouw raciale bijnamen naar hem en zegt dat ze hem kan laten lynchen. Het incident is vernederend voor Crooks, die zich vervolgens moet verontschuldigen bij Curley's vrouw voor Lennie en Candy, ondanks het feit dat ze de verkeerde partij zijn.
Curley's vrouw is een jonge, mooie vrouw wiens naam nooit in de novelle wordt genoemd. Haar man, Curley, is jaloers en wantrouwend en hij snauwt haar regelmatig. Ze heeft een zoete kant, aangetoond wanneer ze Lennie vertelt over haar kinderdromen over filmsterrendom, evenals een wrede streep, zoals blijkt uit de racistische verbale aanval die ze op Crooks lanceert. Curley's vrouw zet de climax van het boek neer door Lennie te vragen haar haar te strelen, waarna Lennie haar onbedoeld doodt. Curley's vrouw is minder ontwikkeld dan andere personages en ze lijkt vooral te dienen om de samenzwering vooruit te helpen en conflicten op te wekken.