John Singleton Mosby, geboren op 6 december 1833 in Powhatan County, VA, was de zoon van Alfred en Virginny Mosby. Op zevenjarige leeftijd verhuisden Mosby en zijn gezin naar Albemarle County in de buurt van Charlottesville. Mosby was lokaal opgeleid, was een klein kind en werd vaak opgepikt, hoewel hij zich zelden terugtrok van een gevecht. Mosby kwam aan de Universiteit van Virginia in 1849 en bleek een bekwame student te zijn en blonk uit in Latijn en Grieks. Als student raakte hij betrokken bij een gevecht met een lokale pestkop, waarbij hij de man in de nek schoot.
Mosby werd van school gestuurd en werd veroordeeld voor onwettig schieten en veroordeeld tot zes maanden gevangenisstraf en een boete van $ 1.000. Na het proces dienden verschillende juryleden een verzoek in voor de vrijlating van Mosby en op 23 december 1853 verleende de gouverneur gratie. Tijdens zijn korte tijd in de gevangenis raakte Mosby bevriend met de plaatselijke officier van justitie, William J. Robertson, en gaf hij aan geïnteresseerd te zijn in rechten studeren. Mosby las wet op het kantoor van Robertson en werd uiteindelijk toegelaten tot de bar en opende zijn eigen praktijk in het nabijgelegen Howardsville, VA. Kort daarna ontmoette hij Pauline Clarke en de twee trouwden op 30 december 1857.
Het echtpaar vestigde zich in Bristol, VA en had twee kinderen vóór het uitbreken van de burgeroorlog. Aanvankelijk een tegenstander van afscheiding, nam Mosby onmiddellijk deel aan de Washington Mounted Rifles (1st Virginia Cavalry) toen zijn staat de Unie verliet. Mosby vocht tijdens de Eerste Slag bij Stierenrennen en ontdekte dat militaire discipline en traditionele soldaten hem niet bevielen. Desondanks bleek hij een bekwaam cavalerist en werd hij al snel gepromoveerd tot eerste luitenant en werd hij adjudant van het regiment.
Terwijl de gevechten in de zomer van 1862 naar het schiereiland verschoven, bood Mosby zich aan als verkenner voor brigadegeneraal J.E.B. De beroemde rit van Stuart rond het leger van de Potomac. Na deze dramatische campagne werd Mosby op 19 juli 1862 gevangen genomen door Union-troepen, nabij Beaver Dam Station. Mosby werd naar Washington gebracht en observeerde zijn omgeving zorgvuldig terwijl hij naar Hampton Roads werd verplaatst om te worden geruild. Opmerkende schepen die het commando van majoor-generaal Ambrose Burnside uit Noord-Carolina hadden ontvangen, rapporteerde hij deze informatie onmiddellijk aan generaal Robert E. Lee bij zijn vrijlating.
Deze intelligentie hielp Lee bij het plannen van de campagne die culmineerde in de Tweede Slag om Bull Run. Die herfst begon Mosby bij Stuart te lobbyen om hem in staat te stellen een onafhankelijk cavaleriecommando op te zetten in Noord-Virginia. Werkend onder de Partijdige Rangerwet van de Confederatie, zou deze eenheid kleine, snel bewegende aanvallen uitvoeren op de communicatielijnen en bevoorrading van de Unie. Op zoek naar zijn held van de Amerikaanse revolutie, partijdige leider Francis Marion (The Swamp Fox), emuleert Mosby uiteindelijk toestemming van Stuart in december 1862, en werd gepromoveerd tot majoor de volgende maart.
Mosby rekruteerde in Noord-Virginia een leger van onregelmatige troepen die partijdige rangers waren. Ze bestonden uit vrijwilligers uit alle lagen van de bevolking, woonden in het gebied, gingen op in de bevolking en kwamen bij elkaar toen ze werden opgeroepen door hun commandant. Ze voerden nachtelijke aanvallen uit op de buitenposten van de Unie en bevoorraden konvooien en sloegen toe waar de vijand het zwakst was. Hoewel zijn kracht in omvang groeide (240 tegen 1864), werd het zelden gecombineerd en raakte het vaak meerdere doelen in dezelfde nacht. Deze spreiding van troepen hield de achtervolgers van Mosby uit evenwicht.
Op 8 maart 1863 vielen Mosby en 29 mannen het Fairfax County Court House binnen en namen brigadegeneraal Edwin H. Stoughton gevangen terwijl hij sliep. Andere gewaagde missies waren aanvallen op Catlett Station en Aldie. In juni 1863 werd het bevel van Mosby opnieuw ontworpen als het 43e bataljon van partizanen. Hoewel achtervolgd door troepen van de Unie, stond de aard van Mosby's eenheid toe dat zijn mannen eenvoudig na elke aanval vervaagden en geen spoor achterlieten om te volgen. Gefrustreerd door de successen van Mosby, gaf luitenant-generaal Ulysses S. Grant in 1864 een bevelschrift uit dat Mosby en zijn mannen als boeven moesten worden aangewezen en zonder proces moesten worden opgehangen als ze werden gevangengenomen.
Toen de troepen van de Unie onder majoor-generaal Philip Sheridan in september 1864 naar de Shenandoah-vallei trokken, begon Mosby tegen zijn achterste te opereren. Later die maand werden zeven van Mosby's mannen gevangen genomen en opgehangen aan Front Royal, VA door brigadegeneraal George A. Custer. Als vergelding reageerde Mosby vriendelijk en doodde hij vijf gevangenen in de Unie (twee anderen ontsnapten). Een belangrijke triomf vond plaats in oktober, toen Mosby erin slaagde Sheridan's loonlijst te veroveren tijdens de 'Greenback Raid'. Terwijl de situatie in de vallei escaleerde, schreef Mosby op 11 november 1864 aan Sheridan met het verzoek om een terugkeer naar de eerlijke behandeling van gevangenen.
Sheridan stemde in met dit verzoek en er vonden geen verdere moorden plaats. Gefrustreerd door de invallen van Mosby, organiseerde Sheridan een speciaal uitgeruste eenheid van 100 mannen om de Zuidelijke partizaan te veroveren. Deze groep, met uitzondering van twee mannen, werd op 18 november gedood of gevangen genomen door Mosby. Mosby, gepromoveerd tot kolonel in december, zag zijn commando oplopen tot 800 man en zette zijn activiteiten voort tot het einde van de oorlog in april 1865. Niet bereid zich officieel over te geven, beoordeelde Mosby zijn mannen voor de laatste keer op 21 april 1865, alvorens zijn eenheid te ontbinden..
Na de oorlog maakte Mosby velen in het Zuiden boos door een Republikein te worden. In de overtuiging dat dit de beste manier was om de natie te helpen genezen, raakte hij bevriend met Grant en diende hij als presidentiële campagnevoorzitter in Virginia. Als reactie op de acties van Mosby ontving de voormalige partizaan doodsbedreigingen en werd zijn jongenshuis platgebrand. Bovendien werd minstens één poging gedaan in zijn leven. Om hem te helpen beschermen tegen deze gevaren, stelde Grant hem in 1878 aan als Amerikaanse consul in Hong Kong. Terug in de VS werkte Mosby in 1885 als advocaat in Californië voor de Southern Pacific Railroad, voordat hij verschillende overheidsfuncties doorliep. Mosby stierf voor het laatst als assistent-procureur-generaal bij het ministerie van Justitie (1904-1910) op 30 mei 1916 in Washington DC en werd begraven op de begraafplaats Warrenton in Virginia.