Hoe knippen restrictie-enzymen DNA-sequenties?

In de natuur moeten organismen zichzelf voortdurend beschermen tegen vreemde indringers, zelfs op microscopisch niveau. In bacteriën is er een groep bacteriële enzymen die werkt door het ontmantelen van vreemd DNA. Dit demontageproces wordt restrictie genoemd en de enzymen die dit proces uitvoeren, worden restrictie-enzymen genoemd.

Beperkingsenzymen zijn erg belangrijk in recombinant-DNA-technologie. Beperkende enzymen zijn gebruikt om vaccins, farmaceutische producten, insectenbestendige gewassen en tal van andere producten te helpen produceren.

Belangrijkste leerpunten

• Beperkingsenzymen ontmantelen vreemd DNA door het in fragmenten te snijden. Dit demontageproces wordt beperking genoemd.
• Recombinante DNA-technologie vertrouwt op restrictie-enzymen om nieuwe combinaties van genen te produceren.
• De cel beschermt zijn eigen DNA tegen demontage door methylgroepen toe te voegen in een proces dat modificatie wordt genoemd.
• DNA-ligase is een zeer belangrijk enzym dat helpt om DNA-strengen samen te voegen via covalente bindingen.

Wat is een restrictie-enzym?

Restrictie-enzymen zijn een klasse enzymen die DNA in fragmenten snijden op basis van het herkennen van een specifieke sequentie van nucleotiden. Restrictie-enzymen zijn ook bekend als restrictie-endonucleasen.

Hoewel er honderden verschillende restrictie-enzymen zijn, werken ze allemaal op vrijwel dezelfde manier. Elk enzym heeft een zogenaamde herkenningssequentie of -plaats. Een herkenningssequentie is typisch een specifieke, korte nucleotidesequentie in DNA. De enzymen snijden op bepaalde punten in de herkende volgorde. Een restrictie-enzym kan bijvoorbeeld een specifieke sequentie van guanine, adenine, adenine, thymine, thymine, cytosine herkennen. Wanneer deze sequentie aanwezig is, kan het enzym verspringende sneden maken in de suiker-fosfaat ruggengraat in de sequentie.

Maar als restrictie-enzymen knippen op basis van een bepaalde volgorde, hoe beschermen cellen zoals bacteriën dan hun eigen DNA tegen het in stukken snijden door restrictie-enzymen? In een typische cel, methylgroepen (CH₃) worden toegevoegd aan de basen in de sequentie om herkenning door de restrictie-enzymen te voorkomen. Dit proces wordt uitgevoerd door complementaire enzymen die dezelfde volgorde van nucleotidebasen herkennen als restrictie-enzymen. De methylering van DNA staat bekend als modificatie. Met de processen van modificatie en beperking kunnen cellen beide vreemd DNA afsnijden dat een gevaar voor de cel vormt, terwijl het belangrijke DNA van de cel behouden blijft.

Gebaseerd op de dubbelstrengige configuratie van DNA, zijn herkenningssequenties symmetrisch op de verschillende standaards maar lopen in tegengestelde richtingen. Bedenk dat DNA "richting" heeft, aangegeven door het type koolstof aan het einde van de streng. Het 5'-uiteinde heeft een fosfaatgroep bevestigd terwijl het andere 3'-uiteinde een hydroxylgroep heeft bevestigd. Bijvoorbeeld:

5'-uiteinde - ... guanine, adenine, adenine, thymine, thymine, cytosine ... - 3 'uiteinde

3 'einde - ... cytosine, thymine, thymine, adenine, adenine, guanine ... - 5' einde

Als het restrictie-enzym bijvoorbeeld in de sequentie tussen guanine en adenine snijdt, zou dit met beide sequenties gebeuren, maar aan tegenovergestelde uiteinden (omdat de tweede sequentie in de tegenovergestelde richting loopt). Omdat het DNA op beide strengen wordt gesneden, zullen er complementaire uiteinden zijn die waterstof aan elkaar kunnen binden. Deze uiteinden worden vaak "plakkerige uiteinden" genoemd.

Wat is DNA-ligase?

De plakkerige uiteinden van de fragmenten geproduceerd door restrictie-enzymen zijn nuttig in een laboratoriumomgeving. Ze kunnen worden gebruikt om DNA-fragmenten uit verschillende bronnen en verschillende organismen samen te voegen. De fragmenten worden bijeengehouden door waterstofbruggen. Chemisch gezien zijn waterstofbruggen zwakke attracties en niet permanent. Met een ander type enzym kunnen de bindingen echter permanent worden gemaakt.

DNA-ligase is een zeer belangrijk enzym dat zowel in de replicatie als in het herstel van het DNA van een cel functioneert. Het functioneert door het samenvoegen van DNA-strengen te helpen. Het werkt door een fosfodiësterbinding te katalyseren. Deze binding is een covalente binding, veel sterker dan de bovengenoemde waterstofbinding en in staat om de verschillende fragmenten bij elkaar te houden. Wanneer verschillende bronnen worden gebruikt, heeft het resulterende recombinante DNA dat wordt geproduceerd een nieuwe combinatie van genen.

Beperking enzymtypen

Er zijn vier brede categorieën restrictie-enzymen: Type I enzymen, Type II enzymen, Type III enzymen en Type IV enzymen. Ze hebben allemaal dezelfde basisfunctie, maar de verschillende typen worden geclassificeerd op basis van hun herkenningsvolgorde, hoe ze splitsen, hun samenstelling en hun stofvereisten (de behoefte aan en het type cofactoren). In het algemeen knippen Type I enzymen DNA op locaties ver van de herkenningssequentie; Type II knippen DNA binnen of nabij de herkenningssequentie; Type III knippen DNA nabij herkenningssequenties; en Type IV splitsen gemethyleerd DNA.

bronnen

• Biolabs, New England. "Soorten restrictie-endonucleasen." New England Biolabs: Reagentia voor de Life Sciences-industrie, www.neb.com/products/restriction-endonucleases/restriction-endonucleases/types-of-restriction-endonucleases.
• Reece, Jane B. en Neil A. Campbell. Campbell Biology. Benjamin Cummings, 2011.