Gram-vlekprocedure in de microbiologie

De Gram-kleuring is een differentiële kleuringmethode die wordt gebruikt om bacteriën toe te wijzen aan een van twee groepen (grampositief en gramnegatief) op basis van de eigenschappen van hun celwanden. Het staat ook bekend als Gram-kleuring of de methode van Gram. De procedure is vernoemd naar de persoon die de techniek heeft ontwikkeld, de Deense bacterioloog Hans Christian Gram.

Hoe de gramvlek werkt

De procedure is gebaseerd op de reactie tussen peptidoglycan in de celwanden van sommige bacteriën. De Gram-kleuring omvat het kleuren van bacteriën, het fixeren van de kleur met een bijtmiddel, het verkleuren van de cellen en het aanbrengen van een tegenkleuring.

1. De primaire vlek (kristalviolet) bindt zich aan peptidoglycan, kleurende cellen paars. Zowel grampositieve als gramnegatieve cellen hebben peptidoglycan in hun celwanden, dus aanvankelijk kleuren alle bacteriën violet.
2. Gram's jodium (jodium en kaliumjodide) wordt toegepast als bijtmiddel of fixeermiddel. Grampositieve cellen vormen een kristalviolet-jodiumcomplex.
3. Alcohol of aceton wordt gebruikt om de cellen te verkleuren. Gram-negatieve bacteriën hebben veel minder peptidoglycan in hun celwanden, dus deze stap maakt ze in wezen kleurloos, terwijl slechts een deel van de kleur wordt verwijderd uit gram-positieve cellen, die meer peptidoglycan hebben (60-90% van de celwand). De dikke celwand van grampositieve cellen wordt gedehydrateerd door de ontkleuringsstap, waardoor ze krimpen en het vlek-jodiumcomplex binnenin wordt gevangen.
4. Na de ontkleuringsstap wordt een tegenkleuring aangebracht (meestal safranine, maar soms fuchsine) om de bacteriën roze te kleuren. Zowel grampositieve als gramnegatieve bacteriën nemen de roze vlek op, maar deze is niet zichtbaar over het donkerdere paars van de grampositieve bacteriën. Als de kleurprocedure correct wordt uitgevoerd, zijn grampositieve bacteriën paars, terwijl gramnegatieve bacteriën roze zijn.

Doel van de Gram-kleurtechniek

De resultaten van de Gram-kleuring worden bekeken met behulp van lichtmicroscopie. Omdat de bacteriën gekleurd zijn, wordt niet alleen hun Gram-vlekgroep geïdentificeerd, maar kunnen ook hun vorm, grootte en klonterpatroon worden waargenomen. Dit maakt de Gram-vlek een waardevol diagnostisch hulpmiddel voor een medische kliniek of laboratorium. Hoewel de vlek bacteriën mogelijk niet zeker identificeert, is het vaak voldoende om te weten of ze grampositief of gramnegatief zijn om een ​​effectief antibioticum voor te schrijven.

Beperkingen van de techniek

Sommige bacteriën kunnen gram-variabel of gram-onbepaald zijn. Zelfs deze informatie kan echter nuttig zijn om de identiteit van bacteriën te verkleinen. De techniek is het meest betrouwbaar wanneer culturen minder dan 24 uur oud zijn. Hoewel het kan worden gebruikt in bouillonkweken, is het het beste om ze eerst te centrifugeren. De primaire beperking van de techniek is dat het foutieve resultaten oplevert als er fouten in de techniek worden gemaakt. Oefening en vaardigheid zijn nodig om een ​​betrouwbaar resultaat te produceren. Ook kan een infectieus agens niet bacterieel zijn. Eukaryotische pathogenen kleuren gram-negatief. De meeste eukaryotische cellen, behalve schimmels (inclusief gist), blijven echter tijdens het proces niet aan de dia kleven.

Gram-kleuringsprocedure

materialen

• Kristalviolet (primaire vlek)
• Gram's jodium (bijtmiddel, om kristalviolet in de celwand te fixeren)
• Ethanol of Aceton (ontkleurer)
• Safranin (secundaire kleuring of tegenkleuring)
• Water in een spuitfles of druppelflesje
• Microscoopglaasjes
• Samengestelde microscoop

Stappen

1. Plaats een kleine druppel bacteriemonster op een dia. Bevestig de bacteriën op de glijbaan door deze drie keer door de vlam van een bunsenbrander te laten gaan. Als u te veel of te lang hitte toepast, kunnen de celwanden van de bacterie smelten, waardoor hun vorm wordt vervormd en een onnauwkeurig resultaat ontstaat. Als er te weinig warmte wordt toegepast, zullen de bacteriën tijdens het kleuren van de dia afwassen.
2. Gebruik een druppelaar om de primaire vlek (kristalviolet) op de dia aan te brengen en deze 1 minuut te laten zitten. Spoel de schuif voorzichtig niet langer dan 5 seconden met water om overtollige vlekken te verwijderen. Te lang spoelen kan te veel kleur verwijderen, terwijl niet lang genoeg spoelen mogelijk te veel vlek achterlaat op gram-negatieve cellen.
3. Gebruik een druppelaar om Gram's jodium op de dia aan te brengen om het kristalviolet aan de celwand te bevestigen. Laat het 1 minuut rusten.
4. Spoel de dia ongeveer 3 seconden met alcohol of aceton, onmiddellijk gevolgd door een zachte spoeling met water. De gram-negatieve cellen verliezen kleur, terwijl de gram-positieve cellen violet of blauw blijven. Als de ontkleurer echter te lang blijft zitten, verliezen alle cellen kleur!
5. Breng de secundaire vlek safranin aan en laat deze 1 minuut rusten. Voorzichtig afspoelen met water niet langer dan 5 seconden. De gram-negatieve cellen moeten rood of roze gekleurd zijn, terwijl de gram-positieve cellen nog steeds paars of blauw lijken.
6. Bekijk de dia met een samengestelde microscoop. Een vergroting van 500x tot 1000x kan nodig zijn om de celvorm en -indeling te onderscheiden.

Voorbeelden van grampositieve en gramnegatieve pathogenen

Niet alle bacteriën geïdentificeerd door de Gram-vlek zijn geassocieerd met ziekten, maar een paar belangrijke voorbeelden zijn:

• Gram-positieve cocci (rond): Staphylococcus aureus
• Gram-negatieve cocci: Neisseria meningitidis
• Gram-positieve bacillen (staven): Bacillus anthracis
• Gram-negatieve bacillen: Escherichia coli