Jefferson groeide op in Virginia en werd opgevoed met de weeskinderen van de vriend van zijn vader, William Randolph. Hij werd van 9-14 jaar opgeleid door een geestelijke genaamd William Douglas van wie hij Grieks, Latijn en Frans leerde. Daarna ging hij naar dominee James Maury's School voordat hij naar het College van William en Mary ging. Hij studeerde rechten bij George Wythe, de eerste Amerikaanse professor in de rechten. Hij werd toegelaten tot de bar in 1767.
Jefferson was de zoon van kolonel Peter Jefferson, een planter en ambtenaar, en Jane Randolph. Zijn vader stierf toen Thomas 14 was. Samen hadden ze zes zussen en een broer. Op 1 januari 1772 trouwde hij met Martha Wayles Skelton. Ze stierf echter na tien jaar huwelijk. Samen hadden ze twee dochters: Martha "Patsy" en Mary "Polly." Er is ook speculatie over het nageslacht van verschillende kinderen door de slaaf Sally Hemings.
Jefferson diende in het Huis van Burgesses (1769-74). Hij argumenteerde tegen de acties van Groot-Brittannië en maakte deel uit van het Correspondentiecomité. Hij was lid van het Continentale Congres (1775-6) en werd vervolgens lid van het Virginia House of Delegates (1776-9). Hij was de gouverneur van Va. Tijdens een deel van de Revolutionaire Oorlog (1779-81). Hij werd na de oorlog (1785-89) als minister naar Frankrijk gestuurd.
President Washington heeft Jefferson benoemd tot eerste staatssecretaris. Hij botste met Alexander Hamilton, minister van Financiën, over hoe de VS met Frankrijk en Groot-Brittannië zouden moeten omgaan. Hamilton wilde ook een sterkere federale overheid dan Jefferson. Jefferson nam uiteindelijk ontslag omdat hij zag dat Washington sterker door Hamilton werd beïnvloed dan hem. Jefferson diende later als vice-president onder John Adams van 1797-1801.
In 1800 was Jefferson de Republikeinse kandidaat met Aaron Burr als zijn vice-president. Hij voerde een zeer omstreden campagne tegen John Adams onder wie hij als vice-president had gediend. De Federalisten gebruikten de Alien and Sedition Acts in hun voordeel. Deze waren krachtig tegengewerkt door Jefferson en Madison die hadden beweerd dat ze ongrondwettelijk waren (resoluties van Kentucky en Virginia). Jefferson en Burr bonden de verkiezingsstemming die een hieronder beschreven controverse tot stand bracht.
Hoewel het bekend was dat Jefferson zich kandidaat stelde voor President en Burr voor Vice President, zou in de verkiezing van 1800 degene die de meeste stemmen ontving als president worden gekozen. Er was geen bepaling die duidelijk maakte wie voor welk kantoor rende. Burr weigerde toe te geven en de stemming ging naar de Tweede Kamer. Elke staat brengt één stem uit; er waren 36 stemmingen voor nodig om te beslissen. Jefferson won met 10 van de 14 staten. Dit leidde direct tot de passage van het 12e amendement dat dit probleem corrigeerde.
Jefferson werd in 1804 door caucus hernomineerd met George Clinton als zijn vice-president. Hij rende tegen Charles Pinckney uit South Carolina. Tijdens de campagne won Jefferson gemakkelijk. De federalisten waren verdeeld met radicale elementen die tot de ondergang van de partij leidden. Jefferson ontving 162 verkiezingsstemmen versus Pinckney's 14.
De rustige overdracht van macht tussen Federalist John Adams en de Republikein Thomas Jefferson was een belangrijke gebeurtenis in de Amerikaanse geschiedenis. Jefferson bracht tijd door met de federalistische agenda waarmee hij het niet eens was. Hij stond toe dat de Alien and Sedition Acts zonder verlenging eindigden. Hij had de belasting op drank die de Whisky-rebellie veroorzaakte, ingetrokken. Dit verminderde de overheidsinkomsten, waardoor Jefferson de kosten moest verlagen door het leger te verminderen, in plaats daarvan te vertrouwen op de milities van de staat.
Een belangrijke vroege gebeurtenis tijdens de administratie van Jefferson was de rechtszaak, Marbury v. Madison, die de bevoegdheid van het Hooggerechtshof om federale handelingen ongrondwettelijk te regeren hebben ingesteld.
Amerika voerde tijdens zijn ambtsperiode (1801-05) een oorlog met de Barbary-staten. De VS hadden hulde gebracht aan piraten uit dit gebied om aanvallen op Amerikaanse schepen te stoppen. Toen de piraten om meer geld vroegen, weigerde Jefferson Tripoli naar de oorlog te verklaren. Dit eindigde in succes voor de VS, die niet langer hulde aan Tripoli hoefden te betalen. Amerika bleef echter betalen aan de rest van de Barbary-staten.
In 1803 kocht Jefferson het grondgebied van Louisiana uit Frankrijk voor $ 15 miljoen. Dit wordt beschouwd als de belangrijkste handeling van zijn administratie. Hij stuurde Lewis en Clark op hun beroemde expeditie om het nieuwe territorium te verkennen.
In 1807 beëindigde Jefferson de buitenlandse slavenhandel vanaf 1 januari 1808. Hij vestigde ook het precedent van Executive Privilege zoals hierboven uitgelegd.
Aan het einde van zijn tweede ambtstermijn voerden Frankrijk en Groot-Brittannië oorlog en waren Amerikaanse handelsschepen vaak het doelwit. Toen de Britten aan boord van het Amerikaanse fregat gingen, Chesapeake, ze dwongen (onder de indruk) drie soldaten om aan hun schip te werken en doodden er één voor verraad. Jefferson ondertekende de Embargo Act van 1807 als reactie. Dit verhinderde dat Amerika buitenlandse goederen exporteerde en importeerde. Jefferson dacht dat dit de handel in Frankrijk en Groot-Brittannië zou schaden. Het had echter het tegenovergestelde effect, wat de Amerikaanse handel schaadde.